Mappatura della diversità nei tripanosomi africani utilizzando la proteomica spaziale ad alta risoluzione

Nature Communications volume 14, numero articolo: 4401 (2023) Citare questo articolo

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I tripanosomi africani sono parassiti eucariotici disseni che impongono un carico significativo di malattie umane e veterinarie nell’Africa sub-sahariana. La diversità tra le specie e le fasi del ciclo vitale è concomitante con distinti tropismi dell'ospite e dei tessuti all'interno di questo gruppo. Qui, i proteomi spaziali di due specie di tripanosomi africani, Trypanosoma brucei e Trypanosoma congolense, sono mappati in due fasi della vita. I quattro set di dati risultanti forniscono prova dell'espressione di circa 5500 proteine per tipo di cellula. Oltre 2500 proteine per tipo cellulare sono classificate in specifici compartimenti subcellulari, fornendo quattro proteomi spaziali completi. L'analisi comparativa rivela le principali vie di adattamento dei parassiti a diverse nicchie biologiche e fornisce informazioni sulle basi molecolari della diversità all'interno e tra queste specie patogene.

I cinetoplastidi sono eucarioti unicellulari flagellati che includono importanti parassiti dell'uomo, del bestiame e delle specie di piante coltivate e sono tipicamente trasmessi dagli invertebrati. All'interno di questa classe ci sono i tripanosomi africani, che infettano collettivamente una serie di mammiferi e causano la tripanosomiasi africana umana e animale. La maggior parte delle ricerche che caratterizzano i tripanosomi africani sono state eseguite con Trypanosoma brucei; in parte perché due sottospecie sono infettive per l'uomo, inoltre, per la relativa facilità della coltura in vitro e della manipolazione genetica di questa specie. T. brucei è stato studiato come parassita, ma anche come organismo modello divergente, con caratteristiche biologiche eucariotiche di interesse sia ben conservate che non canoniche. Le specie correlate, Trypanosoma congolense e Trypanosoma vivax, sono i principali agenti causali della tripanosomiasi bovina. Nonostante la loro importanza veterinaria, su queste specie sono state effettuate molte meno ricerche1. Diverse specie di tripanosomi africani hanno caratteristiche cellulari e infettive distinte, ma le basi molecolari di gran parte di queste sono sconosciute2,3,4,5.

I tripanosomi africani sono esposti a una serie di ambienti esterni diversi durante il loro ciclo di vita e i parassiti differenziano tra una serie di fasi della vita, ciascuna adattata per la crescita e la sopravvivenza nel proprio ambiente attuale o pre-adattata per quello successivo6. Ogni stadio della vita è basato su un'architettura cellulare comune, altamente organizzata, con nucleo polare, con un singolo flagello e una raccolta di organelli a copia singola e multipla. Le dimensioni relative, le posizioni e il contenuto proteico degli organelli variano tra le fasi della vita. Come in tutte le cellule eucariotiche, la localizzazione subcellulare di una proteina nei tripanosomi non solo definisce l'ambiente biochimico di quella proteina, ma anche il potenziale di interazioni molecolari. Quindi, la funzione delle proteine è intimamente legata alla localizzazione delle proteine.

Esistono due approcci principali per determinare la localizzazione delle proteine in una cellula: la microscopia e la proteomica. La microscopia consente la risoluzione precisa di localizzazioni specifiche; può rilevare la variazione tra le cellule all'interno di un campione; e può identificare facilmente proteine localizzate in più siti, sebbene possa soffrire di artefatti di marcatura o di espressione inappropriata. A causa della necessità di ottenere un anticorpo proteina-specifico o di manipolare geneticamente la proteina di interesse, la microscopia è generalmente limitata a un piccolo numero di proteine per studio. Le analisi al microscopio sull'intero proteoma sono set di dati preziosi e ricchi ma sono sforzi non banali e dispendiosi in termini di tempo che sono finora limitati a poche specie: Saccharomyces cerevisiae7, Humans8 e T. brucei9.

La proteomica spaziale, basata sull'isolamento o sull'arricchimento di organelli seguito dalla spettrometria di massa (MS), consente l'identificazione di proteine arricchite in specifiche posizioni subcellulari, solitamente senza la necessità di modificazioni genetiche. Questi metodi si sono rivelati molto efficaci nel rivelare proteine residenti negli organelli o nelle strutture all'interno dei tripanosomatidi, come il mitocondrio, i glicosomi, il flagello e il nucleo10,11,12,13,14. I metodi basati sulla MS ad alto rendimento possono ora essere utilizzati per localizzare sistematicamente migliaia di proteine in un singolo esperimento per molteplici condizioni, stati o tipi di cellule15,16,17,18,19,20,21,22. Tali metodi includono hyperLOPIT (localizzazione iperplessa delle proteine degli organelli mediante etichettatura isotopica)16,23. Si tratta di un approccio proteomico quantitativo in base al quale una mappa spaziale del proteoma può essere risolta senza la necessità di isolare i singoli organelli abilitati dall'applicazione di algoritmi di apprendimento automatico24,25,26,27. HyperLOPIT e le relative metodologie LOPIT sono state utilizzate per generare mappe spaziali di tipi cellulari di mammiferi, insetti, lieviti, piante e protozoi16,21,28,29,30,31,32.

0.85 for all pairwise comparisons), demonstrating the reproducibility between experimental iterations (Supplementary Fig. 7 and Supplementary Data 8)47. Next, to define the spatial proteomes for each cell-type, final classifications were generated by performing TAGM-MAP analysis on each combined 33-plex dataset (Fig. 1A and Supplementary Data 9). Using this approach, 2679 and 2795 proteins were classified in T. brucei BSF and PCF respectively (Fig. 3A, B and Supplementary Data 9). In T. congolense, 2507 and 2504 proteins were classified in the BSF and PCF respectively (Fig. 3A, B and Supplementary Data 9). These four spatial proteomes provide a comprehensive localisation dataset for two closely related species, across two life-stages each, which has not been achieved on this scale before in any parasitic organism./p>

1e3; Average Reporter S/N > = 5; Isolation Interference <= 50%32. PSMs matching to contaminants (cRAP and cRFP) and those with missing values in any of the 11-plex TMT quantitation channels were removed. PSM intensities were sum-normalised then median-aggregated to the protein level. Each 11-plex TMT experiment was then concatenated to form a 33-plex dataset and proteins with missing values in any of the experiments were removed35./p>0.999 and separately an outlier probability <5 E-5. Proteins that did not meet the thresholding criteria were designated as ‘unknown’. To assess the reproducibility of classifications produced by individual experimental iterations, TAGM-MAP was also performed with the default settings on each 11-plex dataset separately. Classifications were retained if they exceeded a localisation probability >0.99. To assess the variability in classification between the experiments, datasets were compared pairwise using the adjusted Rand index which assigns a score of 0 if consistency is what is expected at random and 1 for perfect consistency using the R package mmclust (v1.0.1)47. To avoid inflating or deflating the ARI due to an excess of “unknown” allocations these were filtered before comparison. Analysis using TAGM-MCMC was then used to provide insight into proteins that were unknown according to TAGM-MAP where it could be due to dynamic protein localisation. This model was implemented using Markov-chain Monte-Carlo. The collapsed Gibbs sampler was run in parallel for 9 chains (T. brucei) and 4 chains (T. congolense) with each chain run for 10,000 iterations. Convergence was assessed using the Gelman-Rubin’s diagnostic and all Markov chains were retained for T. congolense; whilst for T. brucei the best two chains were retained. No thresholding criteria was applied with protein allocations and compartment joint probabilities are reported. Joint probabilities were used to evaluate proteins that may exhibit localisation to more than one compartment./p>=2X the number of genes versus the counterpart in T. brucei or T. congolense accordingly. Cases of two-one gene count orthogroups in T. brucei-T. congolense where two fasta header identifiers matched to a single gene identifier were removed from this set in T. brucei./p>