La scelta del primer del gene rRNA 16S ha un impatto negativo

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 12577 (2023) Citare questo articolo

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Il sequenziamento dell'amplicone dell'rRNA 16S o, più recentemente, l'analisi metatrascrittomica sono attualmente gli unici metodi preferiti per la profilazione microbica di campioni contenenti un rapporto predominante tra DNA umano e batterico. Tuttavia, a causa dell’amplificazione fuori bersaglio del DNA umano, i protocolli attuali sono inadeguati per i campioni bioptici. Qui presentiamo un metodo efficiente, affidabile e conveniente per l'analisi del batterioma di campioni clinici in cui predomina il contenuto di DNA umano. Abbiamo determinato il profilo del microbiota in un totale di 40 biopsie umane dell'esofago, dello stomaco e del duodeno utilizzando il sequenziamento dell'amplicone di rRNA 16S con i primer 515F-806R (V4) ampiamente utilizzati mirati alla regione V4, primer 68F-338R e un set modificato di Primer 68F-338R (V1-V2M) mirati alla regione V1-V2. Con i primer V4, in media il 70% delle varianti della sequenza dell'amplicone (ASV) sono mappate sul genoma umano. D'altra parte, questa amplificazione fuori bersaglio era assente quando si utilizzavano i primer V1-V2M. Inoltre, i primer V1-V2M hanno fornito una ricchezza tassonomica e una riproducibilità dell'analisi significativamente più elevate rispetto ai primer V4. Concludiamo che il metodo di sequenziamento dell'rRNA V1-V2M 16S è affidabile, economico e applicabile a campioni umani abbondanti a bassa carica batterica nella ricerca medica.

Nell'ultimo decennio, lo studio del batterioma umano utilizzando metodi di sequenziamento ad alto rendimento indipendenti dalla coltura è diventato una delle tecniche più frequentemente utilizzate per studiare le comunità batteriche che abitano un'ampia varietà di nicchie nel corpo umano1,2. L’accesso alle tecnologie di terza generazione, abbinato alla riduzione dei costi associati al sequenziamento ad alta produttività, ha comportato un passaggio dal sequenziamento del gene dell’rRNA 16S dell’amplicone al sequenziamento dell’intero gene dell’rRNA 16S e al sequenziamento metagenomico/metatrascrittomico in campioni come feci, vagina umana3 o tamponi da la pelle o la cavità orale4 che contengono un rapporto predominante tra DNA umano e batterico. Tuttavia, nei campioni con basse concentrazioni di DNA batterico o in quelli “contaminati” dal DNA ospite come campioni di sangue, urina o biopsia umana, la profilazione del batterioma si basa ancora in gran parte sul sequenziamento del gene 16S rRNA. Poiché la quantità di dati generati è relativamente piccola, non richiede complesse analisi bioinformatiche5 e anche il prezzo è più conveniente. D'altra parte, i risultati del sequenziamento dell'amplicone dell'rRNA 16S dipendono in modo critico dalla scelta delle sottoregioni ipervariabili tra le nove regioni variabili disponibili intervallate nella sequenza genetica altamente conservata dell'rRNA 16S, così come dalla qualità delle informazioni recuperate e dalla tassonomia la precisione può variare in modo significativo a seconda dei set di primer utilizzati6. Attualmente, la stragrande maggioranza degli studi prende di mira la regione della variabile singola V4 come nel protocollo standardizzato ampiamente adottato dell’Earth Microbiome Project (EMP)7 o le regioni della variabile V1–V38 o V3–V59 come nel protocollo a doppia indicizzazione del microbioma umano Progetto (HMP). Ciò è dovuto principalmente al fatto che la piattaforma di sequenziamento Illumina, ampiamente utilizzata, produce solo sequenze brevi (NextSeq, MiniSeq, iSeq ≤ 300 basi e MiSeq ≤ 600 basi). Sfortunatamente, studi recenti hanno dimostrato ripetutamente che la subregione V4 del gene 16S rRNA comunemente preso di mira valuta i taxa comunemente presenti nel corpo umano in modo meno accurato6,10,11. Inoltre, insieme alla regione V3-V5 è particolarmente suscettibile all'amplificazione fuori bersaglio del DNA umano12, specialmente nei campioni bioptici, con conseguente potenziale perdita di taxa rari e risoluzione batterica, quindi una parte significativa dei dati va sprecata.

Qui mostriamo un nuovo protocollo utilizzando un set di primer mirato alla sottoregione del gene rRNA 16S V1-V2 che riduce drasticamente l'amplificazione fuori bersaglio del DNA umano nei campioni bioptici dell'esofago, dello stomaco e del duodeno, aumentando significativamente la diversità alfa e la tassonomia precisione rispetto ai primer comunemente utilizzati mirati alla regione V4. I primer di amplificazione per la regione V1–V2, comprese le funzionalità richieste per il sequenziamento (adattatori e indici per celle a flusso), sono stati ottimizzati per la piattaforma Illumina MiniSeq con una lunghezza di lettura massima di 150 bp, offrendo un'opzione conveniente per qualsiasi laboratorio interessato ad eseguire sequenziamento del gene rRNA 16S ad alto rendimento. Per aumentare ulteriormente le prestazioni delle classificazioni tassonomiche abbiamo incluso la concatenazione di letture accoppiate alla pipeline bioinformatica13.

0.5%) between the datasets from the esophagus and duodenum biopsies showed increased representation of the abundant genera Prevotella, Fusobacterium, and Streptococcus in the V4 dataset and Neisseria, Haemophilus and Rothia in the V1–V2M dataset (Fig. 6). In biopsies from the stomach, we observed increased representation of abundant genera Prevotella and Fusobacterium only in the V4 dataset (Fig. 6). Indeed, the genus Tmx7 was nearly absent from all V4 datasets, and the genus Leptotrichia was nearly absent from V1–V2M datasets (Fig. 6)./p> 1% abundance and compared with our data (Fig. 7). Both data sets, V1–V2M and V4, showed a very high degree of correlation with the bacterial communities in the two standards (Fig. 7B,D). In the case of GM standard, the V4 primers slightly underestimated the genera Veilonella and Limosilactobacillus and the V1–V2M primers slightly underestimated the genus Bacteroides. An analysis of the FRT community showed a slightly higher representation of the genera Bacteroides, Agathobacter and Subdoligranulum in the V4 primer data set and of Anaerostipes in the V1–V2M data set. In general, however, these results show that the V1–V2M primers give comparable data to the V4 primers./p>