Il modello di congiuntiva 3D in vitro a tutto spessore consente la differenziazione delle cellule caliciformi

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 12261 (2023) Citare questo articolo

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La coltura in vitro e la generazione di cellule caliciformi altamente specializzate rappresentano ancora una sfida importante negli equivalenti 3D in vitro congiuntivali. Un modello che comprende tutti i fattori fisiologici, comprese le cellule caliciformi che secernono muco, ha il potenziale per fungere da nuova piattaforma per studi sulle malattie congiuntivali. Abbiamo isolato cellule epiteliali congiuntivali primarie e fibroblasti da biopsie umane. I modelli 3D sono stati generati da strati epiteliali o da una combinazione di quelli con un tessuto connettivo equivalente. Sono stati studiati modelli epiteliali per l'espressione dei marcatori e la funzione di barriera. I modelli a tutto spessore sono stati analizzati per la morfologia delle cellule mucipare caliciformi e l'espressione dei marcatori tramite immunofluorescenza e PCR quantitativa in tempo reale. Semplici modelli epiteliali coltivati ​​all'interfaccia aria-liquido hanno mostrato epiteli stratificati multistrato con cheratinizzazione patologica e senza formazione di cellule caliciformi. La combinazione con un tessuto connettivo equivalente per generare un modello a tutto spessore ha portato alla formazione di un epitelio multistrato stratificato non cheratinizzato e ha indotto la differenziazione delle cellule mucipare caliciformi. Nel nostro modello, un'elevata somiglianza con la congiuntiva naturale è stata ottenuta mediante la combinazione di cellule epiteliali congiuntivali con fibroblasti incorporati in un idrogel di collagene come equivalente del tessuto connettivo. In futuro, il nostro equivalente congiuntivale in vitro consentirà lo studio della differenziazione delle cellule caliciformi, delle patologie congiuntivali e dei test farmacologici.

La congiuntiva contribuisce al film lacrimale della superficie oculare secernendo muco levigante1,2. Le funzioni cruciali della congiuntiva sono la protezione dagli influssi meccanici e patogeni e la capacità di reagire alle sostanze nocive e agli allergeni mediante la produzione di muco regolata da IgE ed eosinofili3. Attraverso questo meccanismo, la congiuntiva contribuisce al sistema immunitario privilegiato della superficie oculare. Influssi avversi come fluttuazioni dell'umidità, malattia dell'occhio secco, allergeni, infezioni e reazioni autoimmuni, ad esempio la sindrome di Stevens-Johnson o il pemfigoide delle mucose, possono causare distruzione congiuntivale e infine cecità4,5.

Nell'epitelio non cheratinizzato sono intervallate da 2 a 9 strati di cellule squamose e colonnari stratificate, cellule caliciformi altamente specializzate. Le loro mucine secrete contribuiscono al film lacrimale per garantire una superficie oculare liscia. Un'alta percentuale della parte interna delle cellule caliciformi è piena di vescicole che contengono muco, mentre i nuclei delle cellule si trovano sul lato basale6. In generale, le mucine dipendono dal tessuto e sono separate in due classi: mucine associate alla membrana e mucine secrete. Nel contesto dell'epitelio congiuntivale, sono state identificate le mucine associate alla membrana MUC1, MUC4 e MUC16, nonché la mucina secreta MUC5AC che forma gel e la mucina solubile secreta MUC71,7. Le cellule caliciformi congiuntivali esprimono principalmente MUC5AC e, in misura minore, MUC161,8,9. Negli ultimi anni sono stati sviluppati sistemi di test congiuntivali in vitro che utilizzano colture 2D e 3D per affrontare la congiuntivite, l'occhio secco, la migrazione dei fibroblasti dello pterigio, la fibrosi e la somministrazione di farmaci e hanno fornito informazioni importanti10,11,12,13. Diversi autori hanno sviluppato modelli 3D complessi che comprendono l'intera struttura congiuntivale, in cui un tessuto connettivo equivalente è stato utilizzato come impalcatura per la coltura delle cellule epiteliali sulla parte superiore. In questi studi sono stati utilizzati scaffold costituiti da collagene I, fibrina o congiuntiva decellularizzata, mentre le matrici di collagene I e fibrina includevano cellule stromali14,15,16. Questi modelli sono stati in grado di affrontare questioni specifiche della ricerca congiuntivale, tra cui differenziazione, studi sull'infiammazione e scopi clinici. Sebbene il muco possa essere rilevato in questi modelli tramite colorazioni ELISA e Alcianblue/PAS, le colture espianti sono difficili da standardizzare e i modelli di congiuntiva generati in vitro mostrano alcune ma non tutte le caratteristiche. Pertanto, c'è ancora bisogno di un modello che combini un epitelio stratificato multistrato con cellule caliciformi e colorazione MUC5AC specifica all'interno delle loro strutture a coppa. Inoltre, la coltura di queste cellule caliciformi specializzate rimane una sfida importante a causa della mancanza o di fattori chiave sconosciuti nel loro sviluppo6.