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Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 13017 (2023) Citare questo articolo

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L’identificazione delle specie è necessaria per prevenire l’introduzione di parassiti delle piante esotiche attraverso il commercio globale. Molti di questi parassiti sono poco studiati e non dispongono di dati sulla sequenza del DNA disponibili al pubblico su cui basarsi metodi di identificazione molecolare rapida. Uno di questi lignaggi è il genere Chrysodeixis, che comprende tre specie di potenziale interesse per le iniziative commerciali degli Stati Uniti: C. includens, C. chalcites e C. eriosoma. Qui descriviamo un metodo per generare robusti profili di rDNA 45S utilizzando il sequenziamento di lettura lunga al fine di chiarire le relazioni evolutive e sviluppare una tecnica di identificazione PCR in tempo reale. Tale strumento di identificazione sarà utile per differenziare rapidamente tra le specie Chrysodeixis oggetto di quarantena laddove i tradizionali metodi di identificazione morfologica sono insufficienti. Metodi molecolari come questo riducono notevolmente il tempo impiegato per identificare ciascun campione, consentono il rilevamento dell'eDNA, aumentano notevolmente la produttività e aumentano la probabilità di rilevamento. I metodi qui presentati saranno generalmente adattabili a qualsiasi taxa di lepidotteri poco studiato che necessiti di un test diagnostico molecolare e, con la regolazione o il test dei primer, potrebbero essere applicati a qualsiasi gruppo per il quale lo sviluppo di profili rDNA in un ambiente da banco si rivelerebbe utile.

La diagnostica delle specie è sempre più importante in un mondo globalizzato in cui la traslocazione di specie mediata dall’uomo (in particolare piante e insetti) si verifica a un ritmo più elevato che mai1,2. Con l’aumento dei movimenti di persone e della spedizione globale di prodotti agricoli, tra cui colture alimentari, fiori recisi e materiale da imballaggio in legno, la capacità di rilevare e identificare rapidamente eventuali insetti associati è fondamentale per limitare l’introduzione e l’insediamento di specie di parassiti invasive3,4. Negli Stati Uniti, le ispezioni di merci e merci nei porti di ingresso e le indagini nazionali per individuare parassiti esotici vengono utilizzate per individuare la presenza di insetti nocivi. L'identificazione di questi esemplari può essere difficile e spesso si basa su una registrazione accurata dell'ospite su cui è stato trovato l'organismo e sull'origine della spedizione, entrambe le quali possono essere contorte a causa del trasbordo attraverso più località5. In molti casi, i parassiti intercettati possono essere identificati solo in base alla famiglia, alla sottofamiglia o al genere. Ciò vale soprattutto per i lepidotteri, che vengono intercettati quasi esclusivamente allo stadio larvale.

Anche l’identificazione degli insetti catturati durante le indagini nazionali è impegnativa perché l’attrazione incrociata delle esche a feromoni può comportare la cattura di dozzine o centinaia di insetti simili non bersagli in un’unica trappola. È auspicabile una rapida identificazione di potenziali bersagli per rilevare specie invasive prima dell'insediamento (ovvero, la fase di latenza6), ma per farlo spesso è necessario dissezionare ciascun campione o un approccio molecolare, come il codice a barre del DNA con citocromo c ossidasi 1 (CO1)7. Entrambi gli approcci richiedono molto tempo e potrebbero non essere affidabili per le specie precedentemente non descritte, scarsamente caratterizzate o prive di dati di sequenza disponibili al pubblico. Per migliorare le possibilità di rilevamento di specie invasive, sono stati sviluppati test molecolari rapidi o ad alto rendimento per alcune specie di insetti nocivi comunemente intercettati e potenzialmente invasivi (ad esempio8,9,10,11). Le tecniche di identificazione molecolare ad alto rendimento non solo aumentano la probabilità di rilevamento, ma riducono anche drasticamente i tempi e i costi necessari per completare le identificazioni, soprattutto nel caso dei test multiplex12,13. Alcune specie che presentano un elevato potenziale di invasione sono anche poco studiate e mancano di informazioni di base come il posizionamento filogenetico e la descrizione delle specie sorelle, la variazione filogeografica all'interno della specie o dati di sequenza disponibili al pubblico7,14.

Sebbene per molte specie sia disponibile un ampio database di sequenze di CO1 (ad esempio, BOLD15, GenBank16), questa regione può essere poco adatta per lo sviluppo di tecniche basate su sequenze di DNA come la PCR in tempo reale a causa dell'elevato contenuto di AT, della bassa variazione interspecie e della /o un'elevata variazione intraspecie derivante dalla rapida evoluzione e dalla deriva genetica17. In queste situazioni, l'identificazione delle specie può spesso essere effettuata in modo affidabile utilizzando regioni di RNA ribosomiale 45S (rRNA). Tra i primi acidi nucleici ad essere sequenziati, l'rRNA 45S è molto abbondante nel genoma e relativamente corto in lunghezza18. L'unità rRNA è composta da ripetizioni tandem strutturalmente conservate costituite da uno spaziatore trascritto esterno (ETS), 18S rRNA, uno spaziatore trascritto interno (ITS) 1, 5.8S rRNA, ITS2 e 28S rRNA19. Queste proprietà dell'rRNA, così come la conservazione della sequenza nelle regioni codificanti e gli alti tassi di evoluzione nelle regioni ITS non codificanti nel DNA ribosomiale sottostante (rDNA), hanno portato all'uso di questo locus per studi filogenetici sull'intero albero dei geni. vita20,21. Da questi studi filogenetici sono state rese pubbliche grandi quantità di dati sulla sequenza di rDNA da cui i ricercatori hanno sviluppato metodi per l'identificazione rapida delle specie. Questi loci sono ideali per tali analisi molecolari perché le regioni ITS sono relativamente conservate all'interno delle specie, altamente variabili tra le specie (sia con mutazioni puntiformi che indel) e presenti in un numero elevato di copie nel genoma. Ciò li rende candidati ideali per lo sviluppo di test PCR basati su sonde8,22,23 e consente l'amplificazione di queste sequenze anche da DNA degradato o in campioni ambientali ad alta complessità24,25. Poiché le sequenze codificanti gli rRNA 18S, 28S e 5.8S sono altamente conservate, lo sviluppo di primer universali per amplificare l'intera regione è possibile anche se non sono disponibili dati sulla sequenza di rDNA per la specie in questione. Tuttavia, a causa dell'elevato numero di copie all'interno di un singolo genoma, esistono differenze nucleotidiche tra le copie all'interno di un individuo. Queste variazioni intraindividuali sono considerate ribotipi26,27 e tale variazione ribotipica dovrebbe essere evitata quando si sviluppa una tecnica affidabile basata sul DNA per l'identificazione delle specie, tuttavia la caratterizzazione della variazione ribotipica è raramente completata. L'uso di un metodo di sequenziamento ad alto rendimento è, quindi, utile per caratterizzare la diversità ribotipica e per la differenziazione tra variazioni fisse e transitorie che esistono tra le ripetizioni.