Arricchimento selettivo delle plasmacellule - Zhejiang Prodotti Caldi Co.,Ltd

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 885 (2023) Citare questo articolo

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Le vescicole extracellulari (EV) si sono dimostrate mediatori chiave del trasporto extracellulare di piccoli RNA. Tuttavia, i portatori di RNA messaggero libero da cellule (cf-mRNA) nei biofluidi umani e la loro associazione con il cancro rimangono poco compresi. Qui, abbiamo eseguito un'analisi trascrittomica del plasma frazionato per dimensioni da cancro al polmone, cancro al fegato, mieloma multiplo e donatori sani. L'analisi della morfologia e della distribuzione dimensionale ha mostrato la riuscita separazione delle particelle grandi e medie da altre frazioni proteiche plasmatiche solubili. Abbiamo sviluppato una strategia per purificare e sequenziare quantità ultrabasse di cf-mRNA da sottopopolazioni arricchite di particelle e proteine con l'implementazione di picchi di RNA per controllare la variabilità tecnica e normalizzare le drastiche differenze intrinseche nella quantità di cf-mRNA trasportata in ciascuna frazione plasmatica. Abbiamo scoperto che la maggior parte del cf-mRNA era arricchito e protetto nei veicoli elettrici con notevole stabilità in ambienti ricchi di RNasi. Abbiamo osservato modelli di arricchimento specifici del cf-mRNA associato al cancro in ciascuna sottopopolazione arricchita di particelle e proteine. I geni differenzianti arricchiti con EV erano associati a specifici percorsi biologici, come il sistema immunitario, la funzionalità epatica e la regolazione delle sostanze tossiche rispettivamente nel cancro del polmone, nel cancro al fegato e nel mieloma multiplo. I nostri risultati suggeriscono che la dissezione della complessità delle sottopopolazioni di EV ne illumina il significato biologico e offre un promettente approccio alla biopsia liquida.

L'RNA libero da cellule (cfRNA), noto anche come RNA extracellulare (exRNA), è presente in molti fluidi corporei, tra cui il liquido cerebrospinale (CSF), la saliva, il siero, l'urina e il plasma1,2,3. I biotipi di cfRNA più comunemente riportati sono i piccoli RNA non codificanti (ncRNA), che includono microRNA (miRNA), frammenti di RNA di trasferimento (tRNA) e RNA che interagiscono con piwi (piRNA)4. Gli studi hanno anche trovato RNA messaggeri (mRNA) e RNA lunghi non codificanti (lncRNA) nei biofluidi5,6,7,8,9. Sebbene il cfRNA sia considerato più fragile e meno abbondante del DNA libero a causa degli elevati livelli di RNasi nel sangue10, diversi studi hanno dimostrato che i miRNA presenti nel sangue sono notevolmente stabili11,12. Molti studi sul cfRNA si sono concentrati sulla caratterizzazione del cf-miRNA grazie alla sua stabilità nei fluidi corporei11,12. Tuttavia, noi e altri abbiamo recentemente dimostrato che i cf-mRNA possono anche portare firme stabili e specifiche per la malattia che possono essere sfruttate come biomarcatori non invasivi8,13,14,15,16,17,18.

I cfRNA sono associati a molteplici sottoclassi di trasportatori tra cui vescicole extracellulari (EV), ribonucleoproteine e anche lipoproteine come: chilomicroni, lipoproteine a densità molto bassa (VLDL), lipoproteine a bassa densità (LDL) e lipoproteine ad alta densità (HDL). I tipi e le proporzioni dei carichi di RNA confezionati in diversi trasportatori possono dipendere dal tipo di biofluido, da fattori pre-analitici e da condizioni fisiologiche o patologiche. Il consorzio di comunicazione dell'RNA extracellulare (exRNA) dell'NIH ha creato una risorsa atlante di exRNA che ha ampiamente confrontato i principali portatori di miRNA attraverso la deconvoluzione computazionale in 19 studi2,19. Questi studi statistici comparativi hanno identificato cinque tipi di carichi di miRNA associati a trasportatori vescicolari e non vescicolari noti2. Mentre questi studi implicavano gli EV come mediatori chiave del trasporto dell'RNA, altri hanno dimostrato che i complessi proteici leganti l'RNA possono trasportare miRNA indipendentemente dalle vescicole nel plasma umano12,13,20. L'identificazione dei trasportatori di cf-mRNA che forniscono stabilità nel plasma ricco di RNasi può rivelare la biologia e la funzione di base, nonché una potenziale forma distinta di biomarcatori specifici del trasportatore per applicazioni cliniche. Nei terreni di coltura cellulare condizionati, è stato dimostrato che il cf-mRNA è associato agli EV13,20. Tuttavia, quali portatori associano al cf-mRNA nel biofluido umano rimane scarsamente caratterizzato1,21.

0.05; *P < 0.05, **P < 0.01, and ****P < 0.0001) with three technical replicates of FR14 and FR58 of plasma pooled from three healthy individuals. c A box plot of negative raw cycle threshold (- raw ct) of individual genes with RNase and/or detergent treatment using qRT-PCR. RNA isolated from combined FR14 and FR58 using three healthy individuals and three technical replicates of control RNA were treated with RNase and/or detergent. Data are analyzed using RStudio and reported as means ± SD of three independent samples./p> 1) between each cancer type and healthy controls within a specific fraction (Fig. 5a). We used permutation tests to evaluate the statistical significance of DE analysis (Supplementary Fig. 9). To analyze the enrichment patterns, we calculated fold change of these DE genes identified between each cancer type compared with controls within each fraction and visualized in a heatmap (Fig. 5a). We found that, compared to healthy controls, the fractionated plasma of lung cancer patients had significantly upregulated mRNAs, specifically 136, 199, 462, 151, 105, and 7 within medium EVs, small EVs, non-EV particles, early-, middle-, and late-eluting protein fractions respectively (Supplementary Fig. 10a). Intriguingly, the heatmap visualization of fold changes in cancer patients compared with healthy controls displayed distinct enrichment patterns of lung cancer-differentiating cf-mRNA, specific to EV and protein subpopulations (Fig. 5b). The majority of DE genes are enriched in specific EV and protein fractions with very few DE mRNA being shared between fractions (Supplementary Fig. 10). To assess the potential roles of these selectively enriched cancer distinguishing gene sets in each plasma fraction, we performed pathway enrichment analysis using g:Profiler curated on gene ontology and Reactome databases, Cytoscape, and EnrichmentMap (Fig. 5a). Differentiating genes enriched in FR14 (medium EVs) from lung cancer were associated with both immune system and metabolic process (Fig. 5c), while DE genes enriched in FR912 (non-EV particles fraction) were implicated in the immune system and myeloid leukocyte mediated response (Fig. 5c). Differentiating genes enriched in FR1619 (early-eluting protein) from lung cancer were enriched in protein localization nucleus, steroid hormone corticosteroid, and defense virus symbiont, while DE genes enriched in FR3033 (late-eluting protein) were enriched in sphingolipid metabolism (Fig. 5c)./p> 1). After DE genes were identified, log2 fold change (log2FC) was calculated by subtracting log2 counts of cancer from individual biological replicates to the mean of corresponding healthy fractions. Gene lists were organized by fraction. DE genes were identified for selective packaging heatmap analysis. Using the DE genes identified from each fraction, g:Profiler was performed on gene ontology biological properties and reactome for functional enrichment analysis. Pathway enrichment analysis was performed using Cytoscape and EnrichmentMap. b Heatmap of gene expression in lung cancer relative to healthy across fractions. c Enrichment map for lung cancer DE genes found in individual fractions using Gene Ontology (Biological properties) and Reactome with FR14, FR912, FR1619, and FR3033 color coded by red, green, purple and yellow, respectively. Cluster represents (i) steroid hormone corticosteroid, (ii) Cellular response chemical, (iii) defense virus symbiont, (iv) regulation myeloid cell, (v) negative regulation response, (vi) toll cell receptor 4, (vii) g1 specific transcription, and (viii) hemidesmosome assembly. Cluster of nodes were automatically labeled using the AutoAnnotate from Cytoscape./p> 1) per cancer type compared to healthy controls within each fraction. Intriguingly, our heatmap visualization of enrichment patterns revealed distinct multiple cancer differentiating cf-mRNA specific to EV and protein fractions (Fig. 6a). Although there is a slight increase in expression of cf-mRNA between small EV-associated lung cancer DE genes with multiple myeloma and liver cancer, the majority of these genes were not differentially expressed within multiple myeloma and liver cancer. In addition, we performed functional enrichment analyses on these combined gene sets and found the majority of biological function related terms were unique for each cancer type and fraction with minimal overlap on humoral response antimicrobial from both FR14 of lung cancer and FR2326 of multiple myeloma (Fig. 6b). These overall selective enrichment patterns associated with multiple cancers within EV subpopulations and protein fractions suggests that distinct cf-mRNA are packaged into different types of extracellular carriers in cancer./p>

1. To test the significance of the differential expression results for each pairwise comparison of cancer to healthy control per fraction, we performed a permutation test in which differential expression analysis between two groups of randomized samples was compared using the DESeq2 package. For each pair, 1000 permutations of random shuffling were performed and the number of differentiating genes with padj < 0.05 were documented for building a histogram, and compared to the number of significant genes (padj < 0.05) for the group with correct labeling./p> 1 from DESeq2 (v1.22.2). For DegPattern analysis from R package DEGreport (v1.18.1), a total of 11,577 differentially expressed genes determined by one-way ANOVA test across plasma fractions with false discovery rate less than 0.05 were used./p>