Proiezione n

Nature Communications volume 14, numero articolo: 5294 (2023) Citare questo articolo

Dettagli sulle metriche

Saccharomyces cerevisiae è un cavallo di battaglia della biotecnologia industriale a causa dell'importanza dell'organismo nella fermentazione alcolica e della suite di sofisticati strumenti genetici disponibili per manipolare il suo metabolismo. Tuttavia, S. cerevisiae non è adatta a produrre in eccesso molti bioprodotti sfusi, poiché la tossicità limita la produzione a titoli elevati. Qui, utilizziamo un test ad alto rendimento per esaminare 108 ceppi di lievito accessibili al pubblico per la tolleranza a 20 g L−1 di acido adipico (AA), un precursore del nylon. Identifichiamo 15 lieviti tolleranti e selezioniamo Pichia occidentalis per la produzione di acido cis,cis-muconico (CCM), il precursore dell'AA. Sviluppando un kit di strumenti per la modifica del genoma per P. occidentalis, dimostriamo la produzione in batch di CCM con un titolo massimo (38,8 g L−1), resa (0,134 g g−1 glucosio) e produttività (0,511 g L−1 h−1 ) che supera tutti i parametri ottenuti utilizzando S. cerevisiae. Questo lavoro ci avvicina alla bioproduzione industriale di AA e sottolinea l'importanza della selezione dell'ospite nel bioprocesso.

Storicamente, il lievito di birra (Saccharomyces cerevisiae) è stato l'ospite microbico preferito per la sovrapproduzione di carburanti, prodotti chimici e prodotti farmaceutici. Tuttavia, a causa del basso valore di molti prodotti chimici sfusi e biocarburanti, le concentrazioni richieste per la produzione su scala commerciale sono spesso tossiche per S. cerevisiae e altri organismi modello. Ad esempio, S. cerevisiae non è in grado di sostenere la crescita in concentrazioni da basse a moderate di butanolo (2%)1, vanillina (0,05%)2, benzaldeide (0,1–0,2%)3 e molti acidi organici (0,25–2,5%) 4,5,6. Gli acidi organici rappresentano una sfida distinta per il bioprocesso, poiché un bioprocesso ideale di acidi organici verrebbe eseguito a pH acido, il che semplifica il recupero a valle della forma non dissociata ed elude l'esigenza di mantenere il pH durante la fermentazione. Tuttavia, la tossicità acida è inversamente proporzionale al pH, poiché gli acidi non dissociati (pH < pKa) si diffondono liberamente nelle cellule e si dissociano nel citosol (pH 5–7)7. Di conseguenza, per evitare la tossicità del prodotto, la coltivazione della maggior parte dei ceppi di S. cerevisiae e di altri microbi produttori di acidi organici viene eseguita a pH > pKa8,9,10.

L'acido adipico è un acido dicarbossilico C6 utilizzato nella produzione di nylon 6,6. Con una produzione annua di tre milioni di tonnellate e un mercato globale di sei miliardi di dollari11, l'acido adipico è stato classificato come una "super merce" dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti12. La domanda globale di acido adipico è attualmente soddisfatta tramite un processo chimico che coinvolge cicloesano e acido nitrico, ma questo metodo utilizza risorse petrolchimiche e libera protossido di azoto, un potente gas serra, spingendo alla ricerca di percorsi più sostenibili per la sua produzione. Non esistono percorsi naturali per la biosintesi dell'acido adipico, ma sono stati proposti almeno otto percorsi biochimici ingegnerizzati per la sua bioproduzione11. Tra queste vie, i progressi maggiori sono stati ottenuti utilizzando la via dell'acido cis,cis-muconico (CCM). Questa strategia impiega tre enzimi eterologhi, 3-deidroshikimato deidratasi, decarbossilasi dell'acido protocatecuico e catecolo diossigenasi, per la sintesi del CCM dal 3-deidroshikimato, un intermedio della via dello shikimato. Il CCM viene convertito in acido adipico tramite idrogenazione da parte degli enzimi enoato reduttasi, tuttavia le varianti batteriche finora caratterizzate funzionano scarsamente nei lieviti ospiti13, ottenendo una conversione molare <0,9% del CCM in acido adipico14. In assenza di un'adeguata enoato reduttasi attiva nel lievito, S. cerevisiae è stata progettata per sintetizzare CCM con titolo, resa e produttività fino a 22,5 g L−1, 0,1 g g−1 di glucosio e 0,21 g L−1 h−1, rispettivamente9,10. Nonostante questi progressi, i processi CCM del lievito vengono eseguiti a pH 5-6, che è ben al di sopra del pKa del CCM (3,87) e mantiene l’acido nella sua forma dissociata per limitare la tossicità del prodotto.

In risposta alla scarsa tolleranza di S. cerevisiae a molti bioprodotti sfusi, l'attenzione si è spostata sullo screening di specie di lievito non convenzionali per fenotipi più adatti alle applicazioni industriali15. La selezione del ceppo è un aspetto critico e spesso trascurato dello sviluppo di bioprocessi, poiché la selezione di un ospite microbico adattato al prodotto finale target può ridurre gli interventi di ingegneria del ceppo, semplificare la separazione a valle, limitare la tossicità del prodotto e migliorare i parametri complessivi del processo16. Ad esempio, Yarrowia lipolytica è un ospite oleoso e osmotollerante che ben si adatta alla produzione di acidi grassi e alcani17, Kluyveromyces marxianus è un lievito termotollerante a crescita rapida18 e Pichia kudriavzevii è un robusto ospite acido tollerante utilizzato per la produzione di diversi acidi organici19. Sono state classificate circa 1500 specie di lievito in più di 100 generi e gli archivi pubblici di colture contengono migliaia di ceppi di lievito distinti. La maggior parte di queste specie di lievito può essere coltivata in laboratorio con terreni standard20 e importanti progressi nel sequenziamento del genoma, nella biologia dei sistemi e nell’ingegneria dei ceppi hanno ridotto drasticamente i costi e la manodopera coinvolti nell’addomesticamento genetico di ospiti non convenzionali. Sono stati sviluppati sofisticati kit di strumenti genetici per diverse specie di lievito, tra cui Y. lipolytica21, K. marxianus18 e P. pastoris22, offrendo nuove opportunità per la selezione dell'ospite oltre Saccharomyces.