Rilevazione specifica dell'attività di semina tau nella malattia di Alzheimer utilizzando cellule biosensori progettate razionalmente

Neurodegenerazione molecolare, volume 18, numero articolo: 53 (2023) Citare questo articolo

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La propagazione della tau simile a quella del prione nei disordini neurodegenerativi implica che la tau patologica mal ripiegata può reclutare la proteina normale e modellarne l'aggregazione. Qui riportiamo i metodi per lo sviluppo di linee cellulari di biosensori sensibili per il rilevamento dell'attività di semina tau.

Abbiamo eseguito la progettazione razionale di nuove sonde tau basate sulle attuali conoscenze strutturali degli aggregati tau patologici nella malattia di Alzheimer. Abbiamo generato linee cellulari stabili di biosensori basate sul trasferimento di energia per risonanza Förster (FRET) e ne abbiamo caratterizzato la sensibilità, la specificità e la capacità complessiva di rilevare la tau bioattiva nei campioni umani. Rispetto alla linea di biosensori di riferimento, il design ottimizzato della sonda ha comportato una maggiore efficienza nel rilevamento della semina tau. La maggiore sensibilità ha consentito di rilevare una quantità inferiore di competenza di semina tau nei campioni di cervello umano, preservando al tempo stesso la specificità per i semi tau presenti nel morbo di Alzheimer.

Questa prossima generazione di cellule biosensori basate su FRET è un nuovo strumento per studiare l'attività di semina della tau nei campioni umani di Alzheimer, specialmente in campioni con bassi livelli di attività di semina, che potrebbe aiutare a studiare i primi eventi patologici legati alla tau.

L'accumulo nel cervello della proteina tau associata ai microtubuli (MAPT) in aggregati insolubili è una delle principali caratteristiche neuropatologiche della malattia di Alzheimer (AD) e di altri disturbi neurodegenerativi denominati tauopatie. La Tau è una proteina intrinsecamente disordinata normalmente presente nel compartimento assonale dei neuroni dove svolge un ruolo nella stabilizzazione dei microtubuli. Nell'AD, le forme iperfosforilate di tau si accumulano nel citoplasma e si aggregano in filamenti elicoidali accoppiati (PHF) che sono strutture filamentose a fogli beta-plissettati [1, 2]. La stadiazione stereotipata di Braak della patologia tau dell'AD dalla corteccia entorinale, all'ippocampo e successivamente alle regioni limbiche [3], è correlata alla perdita di neuroni e al decorso dei sintomi clinici [4,5,6,7,8]. La diffusione degli aggregati tau attraverso regioni anatomiche interconnesse è supportata da un forte insieme di prove. Ad esempio, gli animali transgenici che sovraesprimono la tau mutante P301L nello strato II della corteccia entorinale sviluppano aggregati di tau umani nel giro dentato, modellando la tau endogena del topo nel processo [9]. La capacità degli aggregati tau mal ripiegati di reclutare tau normale in un meccanismo “simile a un prione” è chiamata seeding ed è stata replicata in numerosi modelli sperimentali [10,11,12,13]. Il ruolo della semina nella propagazione della patologia umana è supportato dal rilevamento di tau competente per la semina (noto anche come tau bioattivo) nelle regioni del cervello contenenti patologie evidenti del groviglio neurofibrillare ma anche in regioni successive che sono prive di cambiamenti patologici evidenti, più avanti lungo il sentiero Braak [14]. La propensione alla semina tau nel cervello post-mortem è correlata al tasso di progressione clinica, confermando il ruolo fondamentale di questo fenomeno nell'AD [15, 16].

Lo studio dei meccanismi di semina nella patologia dell'AD è stato notevolmente accelerato dallo sviluppo di una linea cellulare di biosensori tau basata sul trasferimento di energia per risonanza di Förster (FRET) [12]. Questa linea cellulare stabile di rene embrionale umano (HEK 293 T) esprime sonde che sono un mutante pro-aggregante P301S del dominio ripetuto tau 4R (RD, aminoacidi 244–372) fuso con una proteina fluorescente ciano (CFP) o una proteina fluorescente gialla (YFP). L'aggiunta di materiale tau competente per la semina derivato dal cervello di AD o di fibrille tau preformate induce l'aggregazione di queste sonde fluorescenti e il successivo segnale FRET. Il segnale FRET può essere quantificato mediante citometria a flusso 24 ore dopo l'incubazione con semi di tau. Per aumentare la sensibilità del rilevamento dei semi, i liposomi vengono miscelati con materiale competente per la semina per trasdurre i semi nelle cellule [17]. In assenza di liposomi, le cellule biosensori possono essere utilizzate per studiare i meccanismi di assorbimento dei semi [18, 19]. Le cellule biosensori tau sono state utilizzate per amplificare e quantificare in modo specifico piccole quantità di tau bioattivo da vari campioni di AD, inclusi estratti cerebrali utilizzando vari metodi di purificazione, liquido cerebrospinale post-mortem (CSF), liquido cerebrospinale post-mortem lombare antemortem o vescicole extracellulari derivate dal cervello [20,21,22 ,23,24].