Analisi comparativa dell'efficacia per lo sviluppo di cocktail fagici contro più sierotipi di Salmonella e la sua attività di controllo del biofilm

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 13054 (2023) Citare questo articolo

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Le malattie di origine alimentare rappresentano una sfida importante per l’industria alimentare globale, in particolare quelle causate da batteri multiresistenti (MDR). I batteri capaci di formare biofilm, oltre ai ceppi MDR, riducono l’efficacia del trattamento, ponendo una minaccia significativa al controllo batterico. I batteriofagi, che sono virus che infettano e uccidono i batteri, sono considerati un’alternativa promettente nella lotta ai batteri MDR, sia nella medicina umana che nella produzione animale. I cocktail di fagi, comprendenti più fagi, sono comunemente impiegati per ampliare la gamma degli ospiti e prevenire o ritardare lo sviluppo della resistenza ai fagi. Sono disponibili numerose tecniche e protocolli per valutare l'attività litica dei batteriofagi, i metodi più comunemente utilizzati sono i test spot, l'efficienza della placcatura (EOP) e i test di infezione in coltura liquida. Tuttavia, attualmente non esiste una standardizzazione per la quale dovrebbero essere utilizzate le analisi e le possibili differenze tra loro per determinare con precisione la gamma di fagi ospiti e la composizione di un cocktail. Una selezione preliminare utilizzando lo Spot Test Assay ha prodotto quattro fagi per la successiva valutazione rispetto a un pannello di 36 isolati di Salmonella di numerosi sierotipi. Il confronto tra l'EOP e i test di infezione in coltura liquida ha rivelato che l'EOP potrebbe sottostimare l'attività litica dei fagi, influenzando direttamente lo sviluppo del cocktail di fagi. Inoltre, secondo l'EOP, il cocktail di fagi contenente i quattro fagi selezionati è stato in grado di controllare o rimuovere i biofilm formati dal 66% (23/35) degli isolati, compresi quelli che presentavano una bassa sensibilità ai fagi. I fagi sono stati caratterizzati genomicamente, rivelando l'assenza di geni associati alla resistenza agli antibiotici, a fattori di virulenza o alle integrasi. Secondo l'analisi al microscopio confocale a scansione laser, la maturazione del biofilm di un isolato di Salmonella, che mostrava un'elevata sensibilità ai fagi nella coltura liquida e nei test di vitalità del biofilm su piastre a 96 pozzetti ma aveva bassi valori di EOP, è risultato essere inibito e controllato dal fago cocktail. Queste osservazioni indicano che i fagi potrebbero controllare e rimuovere i biofilm di Salmonella durante tutto il loro processo di crescita e maturazione, nonostante i loro bassi valori EOP. Inoltre, l'utilizzo di test di infezione in coltura liquida consente uno studio più preciso delle interazioni dei fagi per la progettazione di cocktail senza tempo e senza sforzo. Pertanto, l’integrazione di strategie e tecniche per valutare in modo completo la gamma di ospiti e l’attività litica dei batteriofagi in diverse condizioni può dimostrare in modo più accurato il potenziale antibatterico dei cocktail di fagi.

Salmonella spp. sono un frequente agente patogeno umano riconosciuto in tutto il mondo come una minaccia per la salute pubblica1. Tra gli agenti patogeni di origine alimentare, la Salmonella è classificata come la terza causa di morte e, pertanto, rappresenta anche un onere economico significativo. L’ultimo rapporto dell’Organizzazione Mondiale della Sanità sul carico globale delle malattie di origine alimentare stima che degli 88 milioni di casi annuali causati dalla Salmonella in tutto il mondo, 123.000 hanno provocato la morte e un totale di 222.000 anni di vita vissuti con disabilità1.

Una delle caratteristiche principali della Salmonella spp. che gli consente la sopravvivenza in ambienti ostili è la formazione di comunità complesse associate alla superficie – biofilm – che rendono difficile controllarne la proliferazione, soprattutto negli allevamenti di pollame, poiché oltre il 50% dei ceppi di Salmonella isolati da polli macellati in Brasile dimostrano la capacità per formare biofilm2,3,4,5. I biofilm aumentano la tolleranza ai biocidi6,7, data l'organizzazione delle cellule all'interno della matrice polimerica, che riduce la penetrazione dell'agente biocida e fa sì che i batteri persistano negli ambienti di lavorazione alimentare per lunghi periodi5,8.

Pertanto, è di grande importanza sviluppare strategie per controllare la Salmonella nella produzione di pollame, con l’obiettivo di ridurre l’uso di antibiotici a causa della comparsa di microrganismi multiresistenti9,10. In questo scenario, i batteriofagi stanno guadagnando interesse come agenti per inibire o distruggere i biofilm11,12,13.

0.001 and < 0.1, and “Inefficient” for ratios ≤ 0.001./p> 0.5, “Medium” for 0.2 ≤ v1 ≤ 0.5, “Low” for 0.001 ≤ v1 < 0.2, and “Inefficient” for v1 < 0.001./p> 107 CFU/mL) of host strain, we assume that 100% phage adsorption has occurred soon following phage addition25./p>

0.05, two-way ANOVA and post hoc Tukey’s multiple comparison test) was observed for phage treated compared to 48 h biofilm control, indicating that the phages in the cocktail did not increase biofilms' growth for any tested isolates./p> 70%), they are from different species (< 95%). The intergenomic similarity between phB7 and phC17 is 86.5%, which also classifies them as different species in the same genus (Fig. 7b). This is reaffirmed by phylogeny analysis by VICTOR34, which grouped the four phages within the same family and genus. However, VICTOR results differentiated all the phages in different species, including phA11 and phC11, although their phylogenetic distance is low (Fig. 7c). This difference between VIRIDIC and VICTOR results regarding species level can be explained by the difference in the calculations and species thresholds used for each one. All four phages were classified in the class Caudoviricetes, family Demerecviridae, subfamily Markadamsvirinae, and genus Tequintavirus./p> 90%) with only five different phages, infecting Salmonella enterica, Shigella sp., and Escherichia coli. For phages phC17/phB7 endolysin genes, BLASTn showed high similarity (> 90%) with seventy-five different phages, infecting Salmonella enterica, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae./p> 0.05, two-way ANOVA and post hoc Tukey’s multiple comparison test) increase the growth of the biofilm for any of the tested isolates in the analysis, reinforcing the high lytic activity of the selected phages. This is of special interest since specific phages modulate several properties of their host, including the possibility of increasing biofilm production45. A more detailed analysis of the interaction of the phages with the Salmonella biofilm can be seen in the CLSM images. At 24 h of incubation, the biofilm was not mature, but initial cell clusters can be observed with high thickness. A phage cocktail applied at this stage could stop the maturation of the biofilm by reducing the cell density and preventing cell clumping after an additional 24 h of incubation since the bacterial cells were not eradicated but are dispersed, which can be inferred as a certain level of phage resistant mutant cells. The elimination of bacteria from biofilm structure by phages shows differences in effects regarding the number of phages (individual phage or phage cocktail)46,47,48, the Salmonella serovars, the stage of biofilm maturation, and the composition of biofilm (mixed or single species)49. Combining phage therapy with alternative treatments or antibiotics can be an excellent strategy to eliminate resistant mutant cells and eradicate biofilms. A recent study by Duarte et al.50 described the synergistic activity of a single phage and a phage-derived lytic protein against staphylococcal biofilms, demonstrating that combining phages with lytic proteins might help curtail the development of phage resistance. The combination of phage with antibiotics was also effective against biofilms, as demonstrated by Dickey and Perrot51, showing the prevention of antibacterial-resistant bacteria, mainly when phage was used first and antibiotic second. However, antibiotic/phage combination must be carefully studied once it could increase the distribution of antibiotic resistance genes or have an antagonistic effect, especially with drugs that act inhibiting nucleic acid or protein synthesis52./p> 0.001 and < 0.1, and “Inefficient” for ratios ≤ 0.00122. A Heatmap comparing EOP values was plotted using GraphPad Prism v. 9.1.1 (GraphPad Software)./p> 0.5, “Medium” for 0.2 ≤ v1 ≤ 0.5, “Low” for 0.001 ≤ v1 < 0.2, and “Inefficient” for v1 < 0.001. A Heatmap comparing the v1 score for individual phages and the cocktail was plotted using GraphPad Prism v. 9.1.1 (GraphPad Software). R v. 4.2.2 was used to plot the comparison of EOP and v1 in a dotplot graph./p>

4 × ODc = Strong biofilm producer./p>